《食品安全導刊》刊號:CN11-5478/R 國際:ISSN1674-0270

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2,4-二硝基苯肼衍生化 ——高效液相色譜法測定面粉中的甲醛

2016-04-19 17:06:15 來源: 食品安全導刊

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  甲醛由于具有強烈的致癌和致畸性,中國食品安全法明確規定禁止在食品中加入甲醛。但是,由于甲醛具有防腐、漂白作用,一些不法分子為了利潤依然違法添加,導致食品安全事件不斷發生,因此,對食品中甲醛含量進行檢測對于維護人民的健康有重要的意義[1]。由于甲醛紫外吸收非常的弱,通過衍生化反應引入有強紫外吸收的基團,這些衍生物可被液相紫外檢測器檢測。本文利用2,4-二硝基苯肼對甲醛衍生化,然后利用高效液相色譜測定面粉中甲醛的含量。

  材料與方法,市售面粉,甲醇,乙腈,2,4-二硝基苯肼均為分析純(AR),購于天津市永大化學試劑有限公司;甲醛為標準品,購于環境保護部標準樣品研究所。

  1.2 實驗原理
 

  在酸催化的作用下,2,4-二硝基苯肼與甲醛反應生成紅色的2,4-二硝基苯腙,然后在紫外的檢測下,經過流動相的洗脫,在柱子上會有保留,從而間接測定甲醛的含量[2]。

  實驗步驟 基本色譜條件

  色譜柱:Eclipase-XDB C18(4.6mm*250mm,5μm安捷倫科技有限公司)柱溫箱溫度:25℃;流動相:乙腈/水=60/40 (V/V);檢測波長:350nm;流速=1ml/min;進樣量為10μL。

  1.3.2 甲醛衍生化初始條件,取一定量的甲醛標準液或者樣品溶液,加入2,4-二硝基苯肼(與甲醛的摩爾比為1:1),加入1ml 0.5mol/L的pH=5的醋酸鈉-醋酸緩沖液,混勻50℃反應30min,取樣采用HPLC進行分析。樣品測定,精確稱量市售面粉0.5g左右,精確到0.001g,然后加水稀釋到50ml的容量瓶中,然后放置于超聲波中超聲30min,并精確取出 5ml,然后加入已經配好的1ml 2,4-二硝基苯肼溶液,1ml pH=5的醋酸鈉-醋酸緩沖液,并加入甲醇定容到10ml的容量瓶中,搖勻,恒溫60℃水浴中保持30 min,然后取出用5000r/min離心2min,經微孔濾膜過濾,濾液用于HPLC分析。

  結果與討論

  衍生化初始pH的考察,2,4-二硝基苯肼與甲醛的親核加成反應要在酸性條件下才能進行,酸度的大小會對反應能否進行到底有重要的影響。在pH介于2-5之間時,隨著pH的升高,甲醛衍生的產物的峰面積增加,也就是pH的升高有助于甲醛衍生化產物的形成。當pH為6時,產物的峰面積反而降低。pH越低,解離出來的質子就越多,過多的質子會和2,4-二硝基苯肼上的氨基形成鹽,會抑制反應的進行。當pH過高,解離出來的質子就越少,羰基就不容易被質子化,反應也不容易進行[3]。因此,選擇pH=5作為衍生化最佳的pH。衍生化初始溫度的考察,在反應體系初始pH=5的基礎上,考察了不同溫度對衍生化的影響。在30℃-60℃之間,隨著溫度的升高,峰面積也在增加,說明溫度升高有利于產物的生成。但是當溫度=70℃時,產物的峰面積反而下降,這可能是溫度過高,甲醛揮發,反應液中甲醛的量偏低,而反應到產物峰面積的減少[3]。因此,確定最佳的溫度為60℃。衍生化時間的考察,在初始pH=5,溫度=60℃的基礎上考察了衍生化時間對衍生化影響。在前30min,隨著時間的延長,衍生化產物的峰面積一直在增加。當大于30 min后,產物的峰面積就不在增加,說明已經反應完全。選定30min為后續的衍生化時間。

  在確定甲醛衍生化的pH為5,溫度為60℃,反應時間為30min的基礎上,考察了不同的衍生化試劑(2,4-二硝基苯肼)與甲醛的摩爾比對產物峰面積的影響。當2,4-二硝基苯肼與甲醛的摩爾比值為1時,甲醛并沒有反應完全,當2,4-二硝基苯肼的量增加到1.2倍時,產物的峰面積達到最大值。2,4-二硝基苯肼得量繼續增加,產物的峰面積也不在增加。也就是說2,4-二硝基苯肼的用量為甲醛的1.2倍時為最佳。

表1 所采用方法的精確度
 

  從表1可以看出,在所稱量的0.5g樣品中平行5次實驗中其平均值為3.35(mg/kg),RSD為4.41%,說明該方法的精確度非常的高。

  所采用方法的回收率

  向市售面粉中加入不同濃度的甲醛標準溶液,并采用上述衍生化并采用高效液相色譜的操作步驟進行。在原有市售面粉中甲醛含量為3.35 mg/kg的基礎上依次加入3ml、6ml、9ml、12ml濃度為1.2μg/ml的甲醛溶液。

表2 方法的加標回收率
 

  從表2中可以看出,樣品的回收率在97.1%-102.1%之間,說明樣品的回收率也非常的高,也說明了該方法的可行性。

  2,4-二硝基苯肼衍生化甲醛的最佳條件pH=5,溫度=60℃,時間為30min,2,4-二硝基苯肼的用量為甲醛的1.2倍時,該方法的RSD為4.41%,樣品的回收率在97.1%-102.1%之間。方法的準確度和精確度都很具有很強的實際應用價值。

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